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ATP熒光檢測儀檢測原理
更新時間:2019-08-23   點擊次數(shù):3193次

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能催化熒光素氧化并產(chǎn)生生物光的一類酶被稱為熒光素酶(Luciferase)。

熒光素酶的種類很多,其中包括:蟲熒光素酶,細菌熒光素酶,其他熒光素酶等,

現(xiàn)在研究和應用多的是螢火蟲熒光素酶,比如北美螢火蟲熒光素酶、日本螢火

蟲熒光素酶、歐洲螢火蟲熒光素酶、北京螢火蟲熒光素酶等。目前,螢火蟲熒光

素酶的發(fā)光體系的研究主要是來自北美螢火蟲,而國內(nèi)生產(chǎn)的熒光素酶大部分也

是通過克隆北美熒光素酶基因方法獲取的。雖然各種熒光素酶結(jié)構(gòu)不同,但其差

別不大,具有同源性。其中以北美螢火蟲熒光素酶為例對其基本特征進行描述:

北美螢火蟲熒光素酶是由單一多肽鏈組成的,含 551 個氨基酸,不含輔助因子

并且大部分氨基酸是非極性氨基酸,分子量約 62kD,等電點是 6.24,在空間結(jié)

構(gòu)中含有兩對二硫鍵,并且有兩個 Trp,它的大吸收值為 562nm。具體蛋白

結(jié)構(gòu)見下圖:

3螢火蟲熒光素酶催化發(fā)光是在 ATP、熒光素和 Mg2+存在下發(fā)出黃綠色熒

光的。一般的多數(shù)科學家認為熒光素酶作為催化劑催化的是 D-熒光素,D-熒光

素氧化發(fā)光而且在一定條件下熒光的發(fā)射強度直接與 ATP 的濃度呈正相關。其

化學反應方程式為:

Luciferin+ATP+O2=Oxyluciferin+AMP+PPi+CO2+Light

反應過程先是熒光素酶與熒光素結(jié)合,然后借高能化合物 ATP 提供的能量,

形成具有高活性的復合物,此復合物與氧氣反應形成過氧化物后,裂解而形成激

發(fā)態(tài)物質(zhì)。熒光素的(LH2)活性中心首先與熒光素酶結(jié)合形成 E-LH2。然后再

與 ATP 作用產(chǎn)生焦磷酸,后發(fā)出熒光:

形成的過氧化物可能是二氧丁環(huán)酮,其裂解反應生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物氧化熒光

素,激發(fā)態(tài)的氧化熒光素發(fā)射光子回到基態(tài)。這一反應簡化為:

42

E-LH +ATP-Mg +O P(L=O)+E-AMP+CO +PPi+h 2 2 2 υ

?

???

具體的化學反應過程如下
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